一类依赖GPX4属于透明细胞癌的肿瘤细
YilongZou,etal.AGPX4-dependentcancercellstateunderliestheclear-cellmorphologyandconferssensitivitytoferroptosis.NatureCommunication
摘要
透明细胞癌（CCCs）是一组高度侵袭性的恶性肿瘤，通常起源于肾脏和卵巢。CCCs以异常的脂质和糖原积累为特征，对广泛的抗癌治疗无效。在此，我们确定了固有的细胞铁死亡敏感性与CCCs中独特的细胞代谢状态有关。这种敏感性超越了谱系和遗传背景，可以通过小分子抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）加以利用。通过CRISPR筛选和脂质组学分析，我们确定缺氧诱导因子（HIF）途径是这种敏感性的驱动因素。在肾脏CCCs中，HIF-2α通过激活缺氧诱导的脂滴相关蛋白（HILPDA）的表达，选择性地富集多不饱和脂肪酸（脂质过氧化反应的限速底物）。我们的研究建议以GPX4为靶标作为CCCs的一种治疗选择，并强调，在难以治疗的癌症中，可以根据形态学和代谢特征所显示的细胞状态来确定治疗方法。
结果透明细胞癌细胞对由GPX4抑制引起的铁死亡具有内在敏感性
为了寻找CCC中可用药的敏感性，我们系统地查询CTRP数据库以筛选CCC选择性药物。CTRP中的CCC细胞系包括17个透明细胞肾细胞癌(ccRCC)和9个卵巢CCC(OCCC)细胞系。与紫杉醇等传统化疗的低疗效相比，三种GPX4抑制剂作为杀死CCC细胞的最有效和最具选择性的化合物:(1S,3R)-RSL3(RSL3)，ML和ML(图1a,b，补充图1a)。GPX4抑制剂在CCC细胞中的敏感性强于任何特定实体肿瘤谱系的敏感性(图1c，补充图1b)。此外，通过使用CancerDependencyMap(DepMap)数据库中的CRISPR和shRNA对GPX4的强烈遗传依赖性，证实了其化学敏感性，该数据库探索了遗传依赖性(补充图1c)。GPX4利用谷胱甘肽选择性地解除脂质氢过氧化物的毒性，并充当铁死亡（一种铁依赖性细胞死亡途径）的守门人。我们的结果表明CCCs本质上容易发生铁死亡。
我们首先通过小分子、CRISPR或shRNA介导的GPX4抑制，在几种常用ccRCC细胞系中验证了GPX4依赖性，包括-O、-P、OS-RC2和RCC10RGB（图1d，补充图2a-c）。用铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）或liproxstatin-1（Lip-1）处理，ccRCC细胞中GPX4抑制诱导的细胞死亡被完全阻断（图1e）。我们使用共价GPX4抑制剂的表征结果与之前使用erastin和L-丁硫氨酸-S,R-亚砜亚胺（BSO）的研究一致，在ccRCC细胞中这些化合物针对细胞中产生谷胱甘肽的不同步骤。此外，如BODIPY-C11所报道的，ML处理诱导了ccRCC但是没有诱导BFTC细胞中脂质自由基的快速积累，证实了铁死亡的参与（图1f，补充图1d）。体内-O异种移植物（图1g-i）和患者来源的原代ccRCC细胞系（图1j，k，补充表1）中重现了这种对铁死亡的敏感性。值得注意的是，ccRCC细胞对铁死亡的敏感性显着高于正常肾细胞（图1d，k），后者具有基础水平的铁死亡敏感性，表明存在诱导铁死亡作为ccRCC治疗策略的治疗窗口。
在卵巢癌中，OCCC细胞对GPX4抑制剂的敏感性显著高于CTRP中其他卵巢癌细胞系，对紫杉醇的敏感性显著低于其他卵巢癌细胞系（补充图2d）。OCCC细胞株ES-2、OVISR和TOV21G对铁死亡的敏感性较强，但至少在一种高级别浆液性癌（HGSC）细胞株OV-90中敏感性较弱（图1l，补充图2e）。Lip-1处理使OCCC细胞免于ML或RSL3诱导的细胞死亡（补充图2e）。此外，CRISPR或shRNA介导的GPX4缺失显著降低了ES-2细胞的活力（补充图2a-c）。ccRCC和OCCC共有的铁死亡敏感性与它们在转录组水平上的相似性一致。此外，常用CCC标记物HNF-1β、PAX8、PLIN2和PLIN3的mRNA水平与CTRP中GPX4抑制剂的敏感性密切相关（补充图2f）。总之，这些结果表明CCC细胞本质上对GPX4抑制诱导的铁死亡敏感。
图1.透明细胞癌细胞对GPX4抑制诱导的铁死亡非常敏感
HIF-1/2α介导CCC对铁死亡的敏感性
虽然铁死亡经常在病理条件下触发，如缺血/再灌注和创伤性脑损伤等，但人们对其内在敏感性的产生机制知之甚少。阐明铁死亡敏感性的潜在机制对于确定合适的受益于诱导铁死亡药物的患者群体非常重要。值得注意的是，CTRP模型对铁死亡的高度可变敏感性与GPX4mRNA的相对水平无关（补充图3a）。虽然来自不同谱系的CCC在基因上仍然不同，但我们通过在-O细胞中进行全基因组CRISPR抑制/抗性筛查，以鉴定ML敏感性的介质，重点描述了CCRCC这一最常见和基因定义最明确的CCC亚型的特征（图2a，补充数据1-3）。在所有三个时间点上，ML敏感性所需的基因中，排名最高的包括酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1），这两个基因之前与铁死亡有关（图2b）；我们验证了这两个基因在CCCs中是导致铁死亡的必要基因（补充图3b-i）。重要的是，我们发现与HIF途径相关的基因，包括EPAS1（编码HIF-2α）、EP、FOSL1、CITED1以及ARNT（编码HIF-1β）在一种或多种条件下均能在顶部筛选结果中富集（图2b）。HIF-2α是ccRCC癌变和获得透明细胞形态的驱动因子，其作为铁死亡调节因子的出现与先前的研究一致，该研究显示VHL恢复降低了RCC4（另一个ccRCC细胞系）中对erastin和BSO的敏感性。使用独立的sgRNA和shRNA文库进行的基因抑制验证了该途径是-O细胞中ML敏感性的介质（图2c，补充数据9和10）。在表达单个HIF-2α靶向sgRNAs和shRNAs的ccRCC细胞中，在EPAS1-GFP表达恢复或未恢复的单细胞EPAS1/克隆中，以及HIF-2α/GPX4双敲除的单细胞EPAS1/克隆中，也观察到依赖于HIF-2α的铁死亡敏感性（图2d-h、补充图4a-f和补充数据8）。虽然HIF-2α的缺失并未影响体外ccRCC细胞的增殖率（补充图4g），但HIF-2α消融显著降低了脂质过氧化水平（补充图4h-i），这有力地表明了铁死亡敏感性的降低。
HIF-2α诱导的铁死亡敏感性强调了癌基因诱导的ccRCC脆弱性的一个突出例子。值得注意的是，在泛癌DepMap分析中，具有VHL突变的癌细胞表现出比VHL野生型细胞更大的GPX4的依赖性（补充图4j）。有趣的是，OCCC肿瘤通过激活HIF-1α模拟子宫内膜囊肿微环境中的缺氧反应。值得注意的是，通过CRISPR去除HIF-1α降低了ES-2细胞对铁死亡的敏感性（补充图4k-l）。总之，我们的结果表明HIF通路是CCC铁死亡敏感性的主要驱动因子。此外，HIF脯氨酰水解酶2（EGLN1）通过破坏A非小细胞肺癌细胞中HIF-1α的稳定性，降低了铁死亡的敏感性，这意味着该途径在其他癌症背景下的铁死亡中具有更广泛的作用。
图2.全基因组CRISPR筛选确定HIF-2α是铁死亡敏感性的驱动因子
HIF-2α选择性富集CCC中的多不饱和脂质
铁死亡是由过氧化膜磷脂，特别是含有多不饱和脂肪酸（PUFA）链的磷脂酰乙醇胺（PEs）引起的，包括花生四烯酸（C20:4）和二十二碳六烯酸（C22:6）。尽管HIF能驱动脂质代谢的广泛重编程并促进癌细胞中的脂质储存，但这些代谢改变如何与铁死亡敏感性相关尚不清楚。为了确定HIF途径如何驱动铁死亡敏感性，我们在EPAS1/单细胞-O克隆中进行脂质谱分析（补充图5a，b，补充数据4）。HIF-2α缺失导致-O细胞的脂质组发生深刻变化，脂滴的主要成分甘油三酯（TAG）和磷脂显著减少（图3a，补充图5c，d）。值得注意的是，与含有饱和/单不饱和脂肪酸链的甘油三酯（SFA/MUFA-TAGs）相比，在对HIF-2α缺失的反应中，PUFA-TAGs表现出最显著的下降（图3a，b）。在缺氧反应期间，ccRCC细胞的TAG饱和度水平也发生了改变。此外，EPAS1/细胞中的大多数PEs和PE-缩醛磷脂（ePE），包括与铁死亡相关的C36:4、C38:4/5/6和C40:6PEs以及C36:5、C38:5和C40:7EPE，均显著减少（图3c，d）。最后，游离PUFA水平也强烈依赖于HIF-2α活性，而游离SFA/MUFA受HIF-2α状态的影响较小（图3e，补充数据5）。大多数这些改变都被HIF-2α-GFP过度表达逆转，支持这些由HIF-2α特异性驱动的事件（图3a-e，补充图5a-d）。重要的是，外源性多不饱和脂肪酸（花生四烯酸，C20:4）处理显著使WT或HIF-2α缺失的-O和-P细胞对铁死亡敏感（图3f）。综上所述，这些数据表明HIF-2α通过选择性富集多不饱和脂肪酸并将其掺入甘油脂质（甘油三酯和磷脂）来驱动铁死亡敏感性。
通过查询先前包含ccRCC正常/肿瘤组织对的脂质组学数据集，我们发现人类ccRCC肿瘤显示出比正常肾组织更高水平的PUFA-PE/ePEs和PUFA-PC/ePCs（图3g）。与低级别样本（I/II期）相比，这些PUFA脂质在高级别肿瘤（III/IV期）中进一步富集（补充图5e）。因此，通常具有组成性活性HIF-2α的人类ccRCC肿瘤处于富含PUFA脂质的细胞状态，并且可能对铁死亡敏感。
图3.HIF-2α选择性富集CCC中的多不饱和脂质
HIF-2α通过HILPDA增加细胞铁死亡敏感性
为了确定HIF-2α在刺激PUFA脂质选择性富集和驱动铁死亡敏感性中的活性下游介质，我们首先确定HIF-2α依赖性基因，然后在EPAS1/细胞中重新表达每个基因，以确定恢复铁死亡敏感性的候选基因（图4a）。我们能够收集RNA-Seq鉴定的个HIF-2α激活基因中77个的cDNA，包括11个脂质代谢基因中的9个（图4b，补充数据6）。RNA-Seq和westernblot分析也排除了HIF-2α诱导的ACSL家族表达的任何显著变化（补充图6a，b）。以ALOX15（15-脂氧合酶-1）作为阳性对照，我们确定缺氧诱导的脂滴相关蛋白（HILPDA，也称为HIG2）和G0/G1期开关调节蛋白2（G0S2）为最重要的再致敏因子（图4c，d，补充图6c，d）。HILPDA和G0S2共享一个同源的PNPLA结合基序（补充图6e），并且每个基序都可以作为脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL，由PNPLA2编码）的共同抑制剂，该酶是TAG水解的限速酶。相反，过表达另一种HIF-2α调节的脂滴相关蛋白perilipin2（PLIN2）不会改变GPX4抑制剂的敏感性（图4c，补充图6c），这表明HILPDA/G0S2下游的特定脂质重塑活性是导致铁死亡敏感性所必需的。
虽然qRT-PCR证实了HILPDA和G0S2对于HIF-2α的依赖性表达（补充图6f），但对-O细胞中先前ChIP序列数据的分析显示HIF-2α/HIF-1β与PLIN2和HILPDA而非G0S2相邻的基因组位点结合（补充图6g），这支持PLIN2和HILPDA作为直接的HIF-2α靶基因；然而，HIF-2α对G0S2表达的调控机制仍有待研究。shRNA介导的内源性HILPDA敲除降低了-O细胞中GPX4抑制剂的敏感性（图4e-g）。然而，即便使用有多种商业可用和验证的抗体，检测CCC细胞中内源性G0S2蛋白表达也被证明是具有挑战性的；四个序列独立的G0S2靶向shRNA没有改变-O细胞的铁死亡敏感性（补充图6h，i）。此外，同时表达HILPDA靶向shRNA和高分G0S2靶向sgRNA的-O-Cas9细胞几乎复制了仅表达HILPDAshRNA的细胞的铁死亡敏感性（补充图6j，k）。总之，这些结果表明HILPDA是介导HIF-2α活性驱动铁死亡敏感性的必要和充分的途径。虽然过度表达的G0S2足以驱动铁死亡的敏感性，但内源性表达的G0S2蛋白在铁死亡中的作用可能并不显著。
在cDNA筛选实验中，我们还将HIF-1α纳入cDNA文库，发现HIF-1α表达使HIF-2α缺失细胞对铁死亡重新敏感（图4c）。重要的是，HILPDA也是HIF-1α靶基因，与其他卵巢癌相比，在OCCC中上调。这些观察结果与HIF-1α在OCCC细胞中诱导铁死亡敏感性的活性一致（参见补充图4k，l），并进一步证实了HIF通路在CCC铁死亡敏感性中的关键作用。
图4.HILPDA富集多不饱和脂质，促进HIF-2α下游的铁死亡敏感性
HILPDA富集HIF-2α下游的多不饱和脂质
接下来，我们通过脂质组学分析确定HILPDA介导CCC铁死亡敏感性的机制。值得注意的是，EPAS1/细胞中的HILPDA表达选择性地恢复了大多数PUFA-PE/EPE和PUFA-TAGs的水平，但几乎不影响SFA/MUFA-脂类（图4h，i，补充图7af，补充数据7）。另一方面，G0S2过度表达诱导磷脂和TAG的整体上调，而与饱和水平无关（图4h，i，补充图7af）。这些结果表明，尽管HILPDA和G0S2具有相似的功能特性，但它们在调节脂质组方面表现出明显不同的选择性，可能是通过与不同的靶蛋白结合。虽然PUFA脂质水平升高是高铁死亡敏感性的关键危险因素，但我们的结果表明HIF-2α对铁死亡增敏作用主要由HILPDA介导。HILPDA对TAG丰度的深远影响促使我们评估HILPDA是否也驱动透明细胞表型。此前已有研究表明，HIF-2α通过激活ccRCC细胞中的PLIN2，积极促进脂滴中的脂质沉积和储存。通过量化脂滴（LD）含量，我们发现HILPDA诱导适度增加，而G0S2和PLIN2诱导LD丰度显著增加（图4j，补充图7g）。这些结果与PUFA-TAG一致，在ccRCC细胞中占总TAG的一小部分，也具有HILPDA依赖性。总的来说，这些数据表明HILPDA是HIF-2α调控的刺激透明细胞形态的分子程序的参与者，而不是主导因素（图4k）。
讨论
CCC患者常面临全身耐药、高转移率和不良预后。在这项研究中，我们系统地描述了CCCs的依赖性，并应用高通量筛选、功能基因组学和代谢组学来剖析潜在的机制。我们发现来自不同谱系的CCC对GPX4抑制诱导的铁死亡具有内在敏感性，确定HIF-HILPDA途径是将这种敏感性与独特的透明细胞代谢状态和形态联系起来的关键分子通路，并建议将GPX4作为CCC的治疗靶点（图4k）。我们的工作指出了将传统组织学与现代化学和基因分析相结合的巨大潜力，以揭示难以治疗的癌症的重要生物学和治疗见解。
我们的研究强调了HIF通路在驱动肿瘤铁死亡敏感性方面的重要作用，并暗示GPX4依赖性细胞状态可能与其他HIF-α活性肿瘤共享，例如嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）。PCPGs是两种罕见的难治性神经内分泌恶性肿瘤，在VHL/HIF途径中表现出频繁的突变。重要的是，PCPG肿瘤也表现出异常的细胞质脂质积聚，因此检测其GPX4依赖性值得进一步研究。此外，由于HIF途径在癌症中驱动多效性下游事件，研究对最近开发的HIF-2α抑制剂产生耐药性的肿瘤是否保留其对GPX4抑制铁死亡的易感性和敏感性将是一件有趣的事情，如果是，GPX4抑制剂是否有助于治疗这些耐药癌症。
我们的工作也为铁死亡潜在机制提供了见解。首先，虽然CCC中的脂滴（LDs）被认为是保护细胞免受脂毒性的不稳定细胞器，但我们的数据表明脂滴中的PUFA-TAGs有助于铁死亡的易感性。值得注意的是，我们的PLIN2过表达EPAS1/-O细胞表明，异常的LD积累不足以驱动铁死亡的易感性（图4c，j）。相反，我们的脂质组学分析和功能分析表明，LD脂质的不饱和度水平在决定对铁死亡的敏感性方面起着更直接的作用，可能通过作为无毒形式的PUFA储存库和PUFA磷脂合成来源发挥作用。尽管PUFA-TAGs/磷脂在癌症中的生理作用尚不清楚，但在包括卵巢癌和乳腺癌在内的多种情况下的癌症干细胞表现出更高的脂质不饱和度水平，这表明铁死亡诱导剂在克服癌症干细胞和转移方面有更广泛的应用前景。
其次，我们的研究强调HILPDA在诱导CCC细胞中HIF-2α下游铁死亡易感状态的强大活性。这种活性是通过HILPDA先前被忽视的选择性来介导的，即富集PUFA-TAGs/磷脂而不是SFA/MUFA-脂质。虽然HILPDA和G0S2均显示抑制ATGL活性，但在HILPDA-和G0S2过表达细胞中的不同脂质谱特征强烈表明存在HILPDA的ATGL非依赖性活性。这种活性，加上对多不饱和脂肪酸脂质的显著选择性，可能有助于CCC和其他情况下的铁死亡易感性。HILPDA脂质选择性的分子基础以及介导PUFA-TAGs和PUFA磷脂之间相互转换的机制值得进一步研究。最近，有报道称，在非酒精性脂肪肝疾病中，与ATGL（PNPLA2）最接近的同源基因PNPLA3的突变等位基因可选择性地将PUFA-TAGs转换为PUFA磷脂。尽管在DepMap的CCC细胞中PNPLA3mRNA水平低于检测下限，但类似的生化途径可能参与将TAG转化为磷脂。尽管如此，本研究提供的见解阐明了LDs60的高度复杂和动态性质，并强调了脂质组的改变如何导致不同的细胞状态。此外，我们的结果表明HILPDA表达可作为预测患者对GPX4靶向药物敏感性的生物标志物。
尽管目前大多数透明细胞肿瘤的诱导凋亡治疗模式受到低反应率和耐药性出现的并发症的挑战，GPX4独特的底物特异性以及它缺乏来自其他过氧化物酶的多余功能，为这些癌症的靶向治疗提供了一个吸引人的范式。然而，由于目前小分子GPX4抑制剂的生物利用度较差，GPX4在癌症模型中的体内化学抑制效果仍有待证明。尽管最近报道的GPX4靶向策略表明有可能克服与传统GPX4抑制剂相关的缺陷，但开发具有改进的药代动力学和药效学特征的新型GPX4抑制剂值得进一步研究。
总之，我们确定了CCC中的组织型特异性铁死亡易感性和GPX4依赖性，描述了这种依赖性的遗传和代谢基础，并阐明了铁死亡细胞死亡的原理。这些见解有可能转化为CCCs和其他涉及铁死亡的疾病的新疗法。
译者：黄颖
编辑：黄琰
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